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【技术】【旧文】蛋白质药物降解比你想象的复杂多了

从本人曾经的微信公众号文章找回。

蛋白质药物的降解在重组药物中十分常见，很少有不发生降解的，它对药物的品质有不可忽视的影响，降解发生的时间与场合是工艺研究的关键问题，而降解发生的机制则很少有人深入探讨，很少有人专门研究通过发酵工艺优化来降低降解产物的，一则头绪不清，二则很费时间和精力与金钱，通过纯化去除降解物则容易实施得多。

作为新药报批的质量研究，降解产物是最重要的有关物质之一，无论如何都要进行研究，而且我们一般要回答以下问题：

          是目标蛋白的降解？还是宿主细胞蛋白残余？
          每个条带是不是唯一降解？
          降解位点在哪里？
          降解机制可能是哪种？

我们曾经开发了一套完整的降解物解析方案，包括多种样本前处理，多层次、多水平、多种检测方式相结合，获得了大量十分有参考价值的数据和结果。

大量降解研究结果显示，单一降解位点的情况较少，一个条带一般含有3~5种以上不同降解的情况，甚至没有主要位点。图1是某重组药物的结果，串联质谱鉴定其降解较单纯：双链中的某一条链发生特异性酶解（来自表达体系），且与空间构象密切相关。

图1 某蛋白药物简单降解例子

在我们的实践中，疫苗的降解非常普遍，有些疫苗降解产物较单纯，有些疫苗降解产物非常复杂（如乙肝疫苗）。HPV疫苗18L1的降解有一定特点（图2）。不同条带均有主要降解位点，如D432、K360、K278、D240，但每个条带都不是单一的剪切蛋白，它主要包含C-端剪切形式，还包含其他剪切方式：N端剪切和中间剪切。

图2 某HPV18L1降解例子

如今质谱技术越来越先进，分子量测定也越来越精确，但对于想快速判断降解位点的企图来说，精确度远远不够。图3是最近我们解析的某药物23kDa条带的情况。质谱获得了该条带内3个组分的分子量，通过分析发现有50个候选序列的偏差小于20ppm，小于10ppm者也有32个。对于1个23kDa的蛋白，即使FT-ICR-MS，要达到10ppm的准确度，并不是件容易的事。你只要看看校正仪器时的准确度就可以知道（不是标准肽校正哦）。质谱仪器验收指标里的内标0.5ppm和外标1ppm，那是小分子或小肽，不是蛋白。在降解分析时，质谱分子量是非常重要的，它能可靠的测出组分数量和分子量范围，是解析C-末端最核心数据之一，但质谱分子量解析降解产物又是十分有限的。

图3 某药物23kDa条带解析例子

我们在有限的研究中发现，有少数特异性酶切位点，这类降解发生在发酵过程中，与发酵体系密切相关，蛋白降解酶一般是宿主细胞分泌的，基本上难以避免，除非添加相关蛋白酶抑制剂。更多的情况是，胞内酶解和水解共存。水解是随机的，与发酵体系的温度、pH、时间、Buffer类型有关，跟细胞似乎关系不大。通过跟踪纯化过程的产物，我们也很惊喜的发现，纯化工艺很少发生再次降解，应该是与大家良好的纯化理念有关。

总之，降解是重组药物司空见惯的事情，大家首先一定要去研究它，最后能较深入研究，要合理控制比例且保持批间一致性。万一宿主细胞蛋白与降解产物混在一起，那得十分严肃认真对待了，具体怎么办，我们可以好好讨论讨论。

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【wkh, 2024-05-28 14:19:33】【责任人 wkh】 [已阅读 368 次]