我们开发原创型诊断试剂有些年头，做过一些探索性研究。从极早期非常糟糕的重复性，到后来任意学生经过培训都能很轻松合格，积累了一点点小经验，肯定比那些长期做免疫分析的团队要逊色，权当我们班门弄斧吧，仅供参考。

1 免疫抗原一定要合适，这是第一步核心。该偶联者要偶联，而且我们更希望是EDC偶联，我们从不使用戊二醛交联法(传统上是这个)。偶联过程的质控特别关键，包括buffer等，我们都是UV和电泳来监测偶联比和偶联率(可参见我们发的论文)。

2 动物免疫貌似大家都是行家，方法多，我们采用的是传统长周期免疫法。阴性对照和阳性对照同步进行。做药物检测者，极好别买商业产品【除非被证明是靠谱的，但实际上，太多市售抗体可能不合适你的研究】。我们购买的小鼠的体重一般是18g~22g，没发现体重对我们的抗体有多大影响。

3 抗体保护剂特别关键。许多ELISA检测的RSD太高者，很大原因是抗体活性没稳定【实际是空间结构变化了以及吸附导致抗原严重丢失】。

4 包板相关技术是典型的“细节决定成败”，从选搬到洗板等等，有许多注意事项，而且与具体检测体系有关。夹心法干扰少，假阳性低，但是相对容易出现波动，主要是抗原表位与2个抗体之间的配合有关系。配对研究有时候需要一年甚至不成功。间接法做起来相对容易得多，精密度也很容易达到要求，但是，假阳性会比较高，尤其是多抗检测时。抗原与NC和PC均不要有交叉。抗原与系统更不能有交叉，比如BSA，否则，运气真的差，必须大幅度改方法。

5 与发光检测不同，ELISA对检测仪器要求不高，也没发现不同仪器有明显差异。但是，OD值质控是必须的。我一般不采用OD<0.1，极低也是0.08。极高线性OD值与仪器有关，应调整到1.5以下极好1.2以下，否则，动态范围会出问题。曾看到有人给的OD居然在3以上，很怀疑是不是满足线性要求。不同的抗体滴度差异大，稀释效应不能忽视。稀释抗原也是如此。

6 抗原与抗体相互作用动力学虽然不尽相同，但多数是反S型，所以，取线性区域的数据是极理想的，这样无论是x~y 曲线还是logx~logy 曲折，结果都没有明显差异。如果线性区的线性关系不太好，log曲线法会显著改善RSD，小于20％是底线，一般能达到RSD<10％。动态范围因此而确定，而且质控品【Q1，Q2】应该尽可能居两端附近。

7 一个免疫抗原会有许多抗体产生，细胞株不同，抗体也不同。know-how谁也不会公开，唯有好好下功夫，耐心筛选，这可以好不夸张的说是个浩大的工程。相比之下，免疫血清天生就不那么容易重复，但是，要尽量做好质控，理论上，越严格越好，实际上要根据项目特点适可而止。



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【wkh, 2019-09-27 17:22:53】 【责任人 wkh】 [已阅读 788 次]