二硫键是稳定蛋白质空间结构极重要的分子基础之一，绝对多数蛋白质的活性与二硫键正确折叠有密切关系。有些蛋白质有自由巯基，一方面是二硫键形成条件不好而产生自由巯基，有些是序列中有奇数Cys。关于自由巯基功能的研究非常少，它对蛋白质的影响还未能达成共识。

本人接触二硫键和自由巯基问题，20多年，从多肽到蛋白，包括抗体，人白等，常常遇到自由巯基活性问题。尤其是，化学合成与基因重组产物的自由巯基和二硫键，很难与天然产物高度一致。尤其是，体内自由巯基多时，差异更大。到底原因有哪些，目前基本上无权威结论。

比较一下体内与体外的差异，能大致判断体内外二硫键和自由巯基的差异。以人体来说，体内细胞介质的构成和pH与体外差异较大，体内温度稳定在37度左右。体内细胞密度比体外发酵要低很多，因为体外表达需要考虑产量，一般人都倾向提高细胞密度。目前极常用的CHO与人体目标蛋白的细胞也有不小差异。

总体上看，人体内细胞蛋白的折叠是个缓慢的过程，二硫键慢慢被谷胱甘肽等氧化剂氧化而成，蛋白质极后会缓慢达到优势构象，形成较稳定的二硫键和自由巯基。有些蛋白，自由巯基大多被氧化，少数蛋白只有少部分自由巯基被氧化，该蛋白的骨架应该有几种限制性空间结构，不能被氧化的Cys之间空间位阻大。

CHO体系接近体内环境，但差异是肯定的。细胞种子筛选是极关键的，一定要选出主要二硫键模式与天源结构一样的细胞，并建立良好的细胞培养工艺，尽量减少异构体产生。然而，对于自由巯基占主导地位的蛋白，CHO体系是很难调控的。

原核表达体系不具备二硫键模板，所以，需要还原全部二硫键再重新进行复性，形成优势二硫键。事实上，复性技术和过程与体内差异显著，只适合简单二硫键蛋白，而且，异构体是难以避免的，全靠纯化了。如果要维持高自由巯基状态，必须添加一定量还原剂，这不是做蛋白药物正确的选择，我成功建议过某些药企干脆做成了双体蛋白，解决了成药性问题。

总之，蛋白质二硫键和自由巯基与蛋白质序列密切相关，也与细胞环境密切相关，进行理性调控是必须的，一般很难与体内高度一致。太多的自由巯基的话，会带来稳定性问题，需要通过处方研究来克服相关不利影响。



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【wkh, 2018-06-09 21:16:22】 【 123.151.77.121】 【责任人 wkh】 [已阅读 1098 次]