二硫键是稳定蛋白质空间结构极重要的分子基础之一，绝对多数蛋白质的活性与二硫键正确折叠有密切关系。半胱氨酸的状态和连接方式还不能被cDNA序列准确预测，二硫键分析是新药报批必不可少的内容，而且不能仅仅分析预期二硫键，更要解析非预期二硫键，这才是“生物类似药到底有多类似”的重要标志，二硫键异构体研究是工艺控制、质量控制、有效性、安全性密切相关的内容。许多企业或CRO在分析二硫键时，都是只看预期二硫键的目标肽，这不仅会漏掉二硫键异构体，甚至可能会错失发现新二硫键模式的可能性。比如，我们曾经研究了多种来源血凝酶的二硫键模式，发现重组血凝酶与天然血凝酶的二硫键模式相差非常大，而且不同文献报道的二硫键模式还不完全一致，如果我们只是以重组产品或文献为依据，那就得全面否则天然血凝酶产品，这显然与生物药开发宗旨相违背。从结构角度看生物类似药，除了序列要一致，还应该二硫键类似、修饰类似（尤其糖型）、电荷异构体类似、二级结构类似、三级结构类似、聚集态结构类似。

二硫键的分析常常是复杂的（图1），尤其是有自由巯基存在时，复杂度更高，即使存在1个Cys，有时候会增加数倍的工作量。一般来说，单一的方法只能解析某些特殊序列和结构的二硫键，大多数情况下，解析二硫键需要多种方法联合进行。

图1 二硫键解析的难点

二硫键解析的方法很多，见图2。当前极主要还是基于质谱的方法，但是不同的二硫键模式需要不同的样品处理，相应的方法也会不同。极近某药企非要采用x-Ray晶体结构法来解析某新药报批的二硫键，我只能说，这个方法没有错，但明显有局限。我们暂且不讨论【晶体结构】与【溶液结构】的差异，仅看晶体测试的要求就能理解它的局限。做晶体结构第一步是获得【良好的单晶】，否则，基本上难以解析出可靠的三维结构。单晶制备过程也是与蛋白本身有很大关系，即使生成了单晶，你选这的那个单晶也只是全部单晶的一个，解出一个单晶的结构不代表样品全部的结构都是这样的。对于那些含量较小的异构体或修饰物，基本上关注不到或做不成单晶，它们的结构信息就丢失了。因此，晶体结构法基本上不能解析二硫键异构体。

图2 二硫键研究常用方法

我们建立了【二硫键综合解析策略】（个别方法为独有），参见图3。这写方法原则上可以满足全部类型的二硫键定位需求，包括预期二硫键和非预期二硫键及其相对比例，也包括自由巯基。但限于时间、成本、样品要求等多方面考虑，有些二硫键研究不能做到特别彻底。

【部分还原氰基衍生氨水裂解法】可以在Cys的N端将蛋白骨架断开，从而理论上可以分析任何二硫键链接模式，是复杂二硫键研究的关键方法之一。该方法首先需要取得被分析蛋白质的理论二硫键肽谱（包括全部异构体）。截止目前，主要是人工来完成，工作量大，极其容易出错。对于大蛋白和复杂二硫键蛋白，这项工作几乎不可以人工完成。遍寻网上相关信息，未找到可以自动产生本方法理论肽谱库的软件或网站。为此，本人花费了大量时间研究该方法的特点，编制了相关软件，分别测试了HSA，FSH等复杂蛋白质的理论二硫键肽谱库。抽查结果显示，软件准确无误。这一软件未见同类产品，属于独家发明。该方法适合含有CysCys结构的短肽的二硫键分析，如果蛋白中有此类情况，常常需要拆分成短肽。

【逐步还原多重烷基化标记串联质谱法】可以灵活运用于许多复杂蛋白的二硫键解析，核心其实就是【大量实验条件设计】，获得足够量的部分还原产物，然后用不同的烷基化试剂标记，再获得足够可靠的碎片离子。常规LC-MS/MS有时候不一定能成功解析，此时可以采用MALDI-TOF/TOF串联质谱法。本方法一般难以独立解析一套二硫键，因此，常需要结合酶切质谱法，使得蛋白质降解为相对简单的肽段。比如，胰岛素二硫键分析，纯酶切质谱法不能确定2对二硫键，一般先进行G酶切，获得AC4-BC2（预期）和AC4-BC1（非预期）。

图3 优化的二硫键研究策略

HSA 有17对二硫键，而且二硫键连接模式很特殊，即使采用2套分析方法（图4），也难以准确解析全部二硫键，此时需要第3套甚至第4套方案了。限制性水解法就像DNA测序一样，是一种“鸟枪法（shot gun）”，除了大量不同实验条件处理样品外，数据解析是极其重要的，也是很复杂的。我们编写了软件并制作了数据库，曾协助解析多家rhHSA和pHSA的二硫键，而且我们发现，靠近末端的二硫键有一定的异构化趋势。

图4 HSA二硫键解析的部分方法

我们极近探索了MALDI串联质谱法，可以直接分析链间二硫键肽。首先，必须有较完善的样品处理方案，不仅仅是极优条件哦；其次是必须获得尽可能全的二硫键相关肽，且肽段丰度分布要较合适；极后还需要多种串联质谱技术相结合，比如ISD、PSD、CID、ECD等。当然，如果你有靠谱的软件，会让你的解析更轻松但别太过依靠软件，人工解析和判断是必要的，这就考验你的质谱功底了。我们是软件+人工相结合的解析法。结果显示，通过对碎片的解析，能获得部分关键二硫键相关碎片，对于后续标记的线性肽的串联质谱解析和验证分析提供了有力的佐证。该方法实验灵活性高，操作方便，样品量少，灵敏度高，通量大，碎片特征性强，实验容易重复，比LC-MS/MS“一过式”技术方便很多，显示出MALDI质谱强大的优势。

当然，跟ESI串联质谱分析二硫键一样，MALDI-MS/MS解析法同样存在局限性，比如，碎片信息不完整，关键碎片残缺或信号太弱，肽段偏好性强，未知二硫键解析困难，等。我们不能简单粗暴的指望它一锤定音，还需要许多其它方法共同配合，还应该进行异构体分析和相对比例分析，尤其要有验证分析，这也是新要报批的基本要求。

从蛋白层次进行二硫键异构体拆分有时候是必须的，图5是某大肠杆菌表达的某蛋白的IEF图，通过胶内条带的二硫键分析，发现它们是二硫键异构体！如果不拆分，其二硫键分布太复杂，结果可靠性一定很低。

图5 二硫键异构体拆分

总之，蛋白质和多肽药物的二硫键是新药报批结构研究的重要内容之一，不仅仅要研究预期二硫键，更要研究非预期二硫键。不仅要证明二硫键存在，还要验证二硫键存在。单一的研究方法一般难以完整解析一个蛋白的二硫键，即使极强大的串联质谱也不可能准确、可靠解析实际样品二硫键（发文章例外）。灵活组合多种研究方案是十分重要的，有时候，还必须有良好的样品制备策略。



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【wkh, 2018-11-03 19:34:25】 【 221.216.155.202】 【责任人 wkh】 [已阅读 1900 次]