【文摘】单颗粒CD-MS解析复杂超大分子（纯文字版，必要时，推出图解版）

天然质谱（Native MS）的局限性是，同一个分子的不同多电荷峰必须被分开且准确归属，才能得到分子量和电荷数，这严重妨碍了超大、不均一的生物分子的分析（因为不满足上述条件）。

以蛋白质聚合物为例，哪怕单体有小变化，其电荷与质量数都会分布很宽，质谱信号会严重重叠，难以解析。一个可能的解决办法是，一个时间只测一个颗粒（或者一个离子）【注：含有1种m/z和1种z】，可以避免信号去卷积，再结合独立的电荷测量，就能实现单颗粒质谱检测（single-particle MS measurements）【注：SP-MS】。现在已经有几种方法来测量百兆级Da分子量了（特别是病毒，1–100 MDa），如，纳电子机械系统（nano-electro-mechanical system–MS ，NEMS–MS)和电荷检测质谱（charge detection–MS，CD–MS)。 需要指出的是，单离子检测（single-ion detection，SID）比FT-ICR早得多。

作者参照Makarov的方法，进行了native MS下的SID分析，发现800 kDa GroEL复合物的电荷数约70。极近，Kafader据称把分辨率提高了1个数量级。本文描述的是，把一个单离子的强度直接关联到电荷态的方法。大致是，测量感应电流的幅度，得到各频率的信号强度，一个单离子的信号幅度应该体现了该离子所带电荷数，与频率无关。如果电荷数与绝对信号强度成比例关系，就可以实现单颗粒的CD-MS【注：sp-CD-MS】，即，每个离子的m/z和z均能被估算出来。样品需要稀释到nanomole范围，缩短采集时间到millisecond级，降低离子流传输。

以Flock house virus (FHV) 颗粒为例。许多种离子被检出，1个m/z对应1个z，如m/z41000对应 220个电荷。电荷很多，信号强度明显高于噪音。每个z对应的单离子强度都有一个小范围，说明有一个离子保活率（survival rate of the ions）的问题，它与超高真空密切相关【注：真空度低，则大量离子无法存活】。这些单离子的质谱峰的分辨率接近仪器的理论分辨率，尽管1个scan里检测非常多的离子，但样品中每个m/z的离子都能被检出且均为单离子【注：需要超高分辨率】。

用一系列蛋白复合物研究了本方法的定量效果，分子量在150 kDa ~ 9.4 MDa，以三乙基乙酸胺为电荷调节剂。以电荷数~单离子强度绘制标准曲线，随机选择200个离子，线性相关系数r2为0.997【注：其实，离子越多，此数据越好】。

本方法的分辨率方面，既能分开相同m/z（z不同）的3MDa超大分子复合物，也能解析IgG寡聚物的电荷重叠现象，动态范围大致是150【注；2个数量级】。

IgM糖基化位点点，修饰非常不均一，导致每个电荷的峰都很宽，还有3个电荷峰重叠严重，常规方法无法准确解析电荷数。采用sp-CD-MS测出其分子量为759kDa、948kDa和1133kDa，对应4聚体、5聚体、6聚体，单体是189kDa，与基于单颗粒强度预测的电荷数和质量数非常接近，如单体为185kDa（仅差4kDa），与无糖IgM分子量173kDa吻合【注：去掉6个糖位点上的寡糖】。

腺病毒（adeno-associated virus,AAV)质粒由3种不同的构件组成，共60个拷贝，化学计量关系复杂，分子量复杂。AAV8构成是1:1:10 (VP1:VP2:VP3)，装载绿色荧光蛋白。sp-CD-MS结果显示，可以区分AAV8空载颗粒【注：无绿色荧光蛋白】和AAV8装载颗粒【注：有绿色荧光蛋白】。AAV8空载颗粒质量数是3740kDa, 与预期相差仅0.3%。AAV8装载颗粒质量数是4910kDa, 两者相差1170 kDa,与预期值1243kDa偏差约1%。

【注：总之，sp-CD-MS克服了天然MS必须准确解析多电荷峰的电荷数这一瓶颈。所用质谱灵敏度必须非常高，分辨率也必须非常高，真空度必须必须非常高，特别适合超大生物分子分析，预期应用前景广阔】。

【注】中内容为摘录者添加。



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【wkh, 2020-03-24 18:17:30】 【责任人 wkh】 [已阅读 1113 次]