自由巯基和二硫键是蛋白质药物维持结构稳定性极核心因素之一，也是维持活性结构的关键因素之一，是新药报批必须研究的内容。

二硫键研究的方法很多，需要看具体情况来定。基于质谱的方法很多，样品处理非常关键。单纯的MS/MS直接解析二硫键，本人亲证不太靠谱（发文章不少），更不用说异构体分析了（因为它的解析是针对已知或假定的二硫键模式解析碎片，如果异构体多，你很难去假定它们）。蛋白质二硫键解析很少采用NMR，估计是解析太复杂了。晶体结构法是一个不错的方法，但是，它肯定解决不了二硫键错配的情况，而且结晶条件（我看也挺复杂的）是否会发生“scramping”，没见相关研究报道。

本人从1994年开始解析多肽二硫键,做过可能超过100个蛋白或多肽了。其中，极复杂的应该是HSA，不仅二硫键多，而且连接模式怪异得很（图1），非常不容易敲定，尤其是N-端区域和C-端区域，柔性较大，异构的概率较高，中间部分倒很稳定。

今年我们又解析了一个重组蛋白的复杂二硫键，共解析出19对二硫键，其中，预期二硫键16对（图2），非预期二硫键3对。采用了多种样品处理组合和多种质谱组合，先进行了定性鉴定和验证，再进行多种相对比例统计分析，结果显示，预期二硫键占98%左右，非预期二硫键占2%左右，该药物是“高保守性、低随机性”的二硫键蛋白。该二硫键研究历时4个月。

图1 HSA预期二硫键模式

图2 某蛋白药物预期二硫键模式（16对，另有3对非预期二硫键）

【wkh, 2019-05-24 10:39:01】 【责任人 wkh】 [已阅读 1177 次]