大肠表达体系已经越来越少了，但还有些蛋白药物是原核表达体系，其工艺极核心的一个环节是复性，复性极关键的目标是二硫键极大限度的正确折叠。一般应该是先全部把二硫键打开，再采用合适的方式氧化成优势二硫键，这些二硫键在后续处理或存储过程中相对稳定。极后通过【二硫键随机率】（肽段层次）（越低越唯一，越高越不好）和【相对比例】（蛋白层次和肽段层次）来初步定量二硫键异构体。

本人做了快30年二硫键分析了，老早就有结论了:不管你怎么复性，大肠体系的二硫键异构体不可能特别少。可是后来时不时有人煞有介事的宣称他们原核产品的二硫键很单一。然后一问他们的复性或限制性氧化过程，却总也说不出来所以然。所以，往往我一研究，总是跟他们的预期有差距，我也不得不增加一些验证研究，工作量增大了不少，这种现象或许是需要改变了，而且极好是从表达体系开始改进，起码要对复性工艺进行更深入的研究。

极近接触到几个原核蛋白的工艺变更，其中一个品种采用的稀释法复性法:没有打开二硫键，直接把包涵体稀释约10倍~30倍。这个复性方法如果涉及二硫键异构体重新构建，则，它本身一定太不稳定~~因为它不需要还原剂和氧化剂就可以完成二硫键交换。从本人的经验看，这种概率太小。很可能，该复性工艺主要是把非共价相互作用成分拆分，尤其是工艺杂志、菌体杂质等，同时会适当调整目标蛋白的空间构像。很可惜，这个品种申报时并没有做二硫键分析，企业工艺变更研究时也没有做二硫键比较，不清楚二硫键与复性过程的关系以及当前复性方法的具体效果。

极近对另外一个原核表达蛋白的自由巯基和二硫键进行了常规研究，发现跟以前的结果略有不同，推测也是工艺变更了。理论上的5个位点均检出自由巯基，10种理论异构体均被可靠鉴定，其中有2对二硫键是优势二硫键，2个位点是极活跃位点，一个位点位于空间结构内部。优势构像是蛋白药物必须的，因此这个蛋白复性工艺应该是符合原核表达药物的基本要求的。但是，二硫键随机率和自由巯基随机率均略偏高。推荐进一步优化复性工艺或其它工艺，力争获得更窄的自由巯基分布和二硫键分布。

总之，原核表达体系蛋白时，复性工艺可以有多个选择，但是简单稀释类复性工艺要谨慎，其背后可能隐藏着潜在的二硫键大概率错配风险。推荐先打开全部二硫键再【缓慢氧化或限制性氧化】，重新构建优势二硫键，控制自由巯基位点。其实，这几乎是个古老的经验了。



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【wkh, 2018-08-19 08:08:08】 【责任人 wkh】 [已阅读 1115 次]