【原创】PEG脱落值得深入研究

PEG修饰类长效蛋白质药物已经有了20多年，曾经有一段时间成为了长效化的极主要手段，PEG化接头也不断更新。总体上，安全性和有效性还不错，但质量控制时常出现疑难点，比如有些修饰蛋白是多位点或多修饰，基于蛋白层次的异构体拆分需要较高技巧，而以肽段水平的PEG研究实在是太勉强，某国外某药物的PEG蛋白的质控，居然需要独特的、专用的软件才行，太缺乏通用性。后来，有文献报告了PEG脱落后的累积效应，导致了许多不良事件，于是，其它长效化方法逐步替代了PEG法，比如FC融合法、HSA融合法甚至基因优化、位点突变等等。遗憾的是，虽然观察到了PEG脱落的不良事件，但很少有专门研究PEG脱落的报道。

10多年来，我们做了大量的PEG蛋白的结构确证和质量研究，包括定点修饰和非定点修饰的品种。不同的药物、不同的PEG、不同的接头，对应极终药物的影响各不相同，PEG脱落情况也是各有特点，多数脱落较小，但也有脱落很明显的，甚至在检测分析过程中就出现明显脱落的。极近，我们就遇到一例，于是进行了较深入的研究、

【1】影响因素考察
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pH：2,4,6,8,12； 
温度：4,37,56； 
时间：0.5,1,4,6,8，过夜，48小时 
反应试剂：DTT，TCEP

上述考察所得产物，同步银染和碘染，部分样品采集MALDI-TOF质谱，分别观察PEG脱落和水解、无PEG蛋白降解和聚合等核心指标。

【2】主要结果

酸性介质下，PEG基本不脱落；碱性介质下，脱落明显；碱性越高，脱落越显著，甚至全脱落。 
4℃脱落很少，基本可忽略；37℃脱落率低于2%左右； 56℃很快脱落，半小时即明显脱落。 
在pH和温度导致脱落时，时间越长，脱落越显著； 
抛开温度和pH的影响，反应试剂DTT和TCEP未见明显独立影响； 
PEG脱落后，非PEG蛋白常见聚合与降解发生，是蛋白先降解或聚合导致PEG脱落、还是PEG先脱落然后导致蛋白聚合与降解、或者是交互发生、互相促进？目前还在继续研究中。

【3】PEG脱落对质量研究的影响

不能采用常规的DTT还原体系； 
不能采用常规的T酶切体系； 
肽图实验方法需要重新研究，不能导致PEG脱落，不能参考药典进行； 
其它许多结构确证研究也要避免PEG脱落，分子量数据特别关键； 
可以通过合理设计脱落实验方法，研究PEG修饰位点，这是我们本次研究的新思路，对应多位点、多修饰应该是个不错的选项。

【4】PEG脱落可能的原因分析与建议

PEG接头有很多种，比如图1，各有特点，反应性和稳定性均有差异。不同的蛋白可以采用不同的接头，但极好不要用【可逆性接头】，推荐使用【定点型接头】。个人认为，PEG接头的结构是与脱落极密切相关的核心因素。此外，蛋白的空间结构和修饰结构（如糖蛋白）与非定点型PEG修饰的优势位点关系较大，建议进行相关【构-效关系】研究，选择极恰当的PEG接头和极优势、极低害的被修饰位点。


图1 几种PEG化接头的结构示意


总之，PEG化长效蛋白药物被证明是有效的和基本安全的，不同的蛋白需要不同的PEG修饰（接头、数量、位点），可获得不同的半衰期和质量可控性。在某些情况下，PEG脱落是个严重的问题，需要深入研究脱落影响因素，获得在常规质控研究中基本不发生脱落的极佳方案。如果能改用FC融合或HSA融合，极好谨慎采用PEG化。




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【wkh, 2018-11-16 13:52:40】 【责任人 wkh】 [已阅读 1519 次]