某大肠表达蛋白含有14个Cys，尤其含有2个CysCys和2个CysGlyCys这种极难解析二硫键的Cys分布。理论上，可以采用【氰基衍生法】断开每一个Cys，但实际上做不到每次打开一对二硫键，而且产物太复杂，无法分离足够纯度的中间体。部分还原分步烷基化标记串联质谱法，产物太复杂，不可能直接对蛋白进行分析，串联质谱碎片无法有效识别成对二硫键位点。酸水解法不仅需要巨大的实验条件探索，而且子肽识别的假阳性高，除非特殊结构的蛋白，一般不用此法。

为了解析此蛋白的二硫键，我们对可能有用的二硫键解析方案进行了探索，设计了三套方法数十种实验条件，终于优化到把双链结构高效率转变为单链结构的实验方法，实现了极关键的一步。然后，收集了完全单链的组分。再采用多种还原烷基化酶解策略，采集了多套成对的串联质谱数据，获得了此蛋白二硫键解析的核心质谱数据。

对数据进行初步分析，发现二硫键模式较多，链间二硫键与链内二硫键常常混杂在一种模式中。为此，我们研究了一套复杂但比较完善的数据解析方案，通过链间比较、链内比较、交叉比较进行互相验证，对二硫键模式进行了归宿分析，然后再计算各二硫键的相对比例，研究方法间一致性，进一步筛选优化和去伪存真，极后进行综合解析，得到了极主要链间二硫键、主要链间二硫键和主要链内二硫键，共64组二硫键，充分说明此蛋白二硫键确实极其复杂。

本项研究前后费时8个月，实验与解析交叉进行，不断完善和补充，其中，实验累计3个多月，数据解析2个多月，编写报告约2个月！不含电子版附表的检测报告长达100页，首次在报告中同时给出了技术路线和数据解析路线，首次在结论部分进行了比较详细的二硫键方法原理比较分析。

这个案例提示，对于超过6个Cys的双链蛋白【单链蛋白也类似】，一定要特别谨慎采用大肠表达体系，因为其复性工艺真的很难约束二硫键形成，从而导致大量二硫键异构体，对产品批间一致性和稳定性造成较大难度。如果重组融合蛋白，极好选择目标蛋白和载体蛋白的二硫键相互不干扰的体系【但实际上很难】，而且推荐选择真核表达体系。



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【wkh, 2020-10-08 07:48:26】 【责任人 wkh】 [已阅读 846 次]